ส่งข้อความ
ติดต่อเรา
Selina

หมายเลขโทรศัพท์ : +86 13989889852

WhatsApp : +8613989889852

การตรวจสอบสุขภาพของอวัยวะที่เป็นของแข็งหลังการปลูกถ่ายโดยใช้ DNA ปลอดเซลล์

June 15, 2020

การวินิจฉัยตาม cfDNA อาจทำให้เนื้อเยื่อเนื้อเยื่อล้าสมัย
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. การตัดชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อที่มีราคาแพงและรุกรานเพื่อตรวจจับการปฏิเสธ allograft หลังจากการปลูกถ่ายมีข้อ จำกัด มากมาย Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. การตรวจโดยอาศัย DNA ปลอดเซลล์ (cfDNA) ซึ่งเป็นชิ้นส่วนของ DNA ที่ถูกปล่อยออกมาจากเซลล์เนื้อเยื่อและอวัยวะเมื่อได้รับการตายของเซลล์ตามธรรมชาติได้รับการศึกษาอย่างเข้มข้นเมื่อเร็ว ๆ นี้และในที่สุดสามารถปรับปรุงความสามารถในการตรวจจับการปฏิเสธ และยังช่วยเพิ่มความอยู่รอดในระยะยาวของอวัยวะที่ปลูกถ่าย
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. CfDNA ยืนยันว่าหลีกเลี่ยงความจำเป็นในการหาลำดับจีโนมทั้งหมด (WGS) และความต้องการความรู้เบื้องต้นของผู้บริจาคและ / หรือจีโนไทป์ผู้รับมีข้อได้เปรียบด้านลอจิสติกส์ที่ทรงพลังและอยู่ภายใต้การตรวจสอบทางคลินิก In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. นอกจากนี้การปรับปรุงความรู้เกี่ยวกับจลนพลศาสตร์เฉพาะอวัยวะของ cfDNA (dd-cfDNA) ที่ได้รับจากผู้บริจาคหลังจากการปลูกถ่ายได้ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการตรวจเหล่านี้ Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. ห้องปฏิบัติการยังได้แนะนำวิธีการทางเลือกสำหรับการวัดปริมาณ dd-cfDNA เช่นปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสดิจิตอล (PCR) และรูปแบบ DNA methylation ของอวัยวะเฉพาะอวัยวะ As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. เช่นนี้สนามของการวินิจฉัยการบุกรุกน้อยที่สุดตาม cfDNA มีแนวโน้มมากขึ้นในวันหนึ่งอาจเปลี่ยนเนื้อเยื่อเนื้อเยื่อแบบดั้งเดิม
บทบาทของ CFDNA ในการฟื้นฟูอวัยวะ
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. การปฏิเสธหมายถึงการบาดเจ็บของอวัยวะที่บริจาคซึ่งเกิดจากระบบภูมิคุ้มกันของผู้รับสามารถทำให้เกิดความผิดปกติของ allograft และแม้แต่ผู้ป่วยที่เสียชีวิต T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). T-cell สื่อกลางเซลล์ปฏิเสธ (ACR) เกิดขึ้นบ่อยที่สุดภายใน 6 เดือนแรกหลังการปลูกถ่าย (1) ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. ACR เกี่ยวข้องกับการสะสมของ CD4 + และ CD8 + T-cells ในพื้นที่คั่นระหว่างหน้าของ allograft เนื่องจากระบบภูมิคุ้มกันของผู้รับรับรู้แอนติเจนในอวัยวะที่บริจาคเป็นต่างประเทศ These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. T-cells เหล่านี้เริ่มต้นระบบภูมิคุ้มกันล้มเหลวที่นำไปสู่การตายของเซลล์ที่ตั้งโปรแกรม (apoptosis) ของเซลล์เป้าหมาย As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). เมื่อเซลล์เหล่านี้ตาย DNA จีโนมจะถูกแยกออกและชิ้นส่วนของ dd-cfDNA ซึ่งมีความยาวประมาณ 140 คู่เบส (bp) ถูกปล่อยออกมาเพื่อรวมตัวกันของ cfDNA ในเลือดและถูกขับออกทางปัสสาวะในที่สุด (2)
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. cfDNA หมุนเวียนได้รับการยกระดับเป็นเครื่องมือวินิจฉัยเพื่อแทนที่ biopsies รุกรานในพื้นที่อื่น ๆ ของการแพทย์รวมถึงการวิเคราะห์เศษดีเอ็นเอของทารกในครรภ์ภายในการไหลเวียนของมารดาเพื่อระบุความผิดปกติทางพันธุกรรมในมดลูกและลำดับการไหลเวียนของดีเอ็นเอที่ปล่อยจากเซลล์มะเร็ง In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). ในทั้งสองกรณีนี้เช่นเดียวกับในการปลูกถ่ายการจัดลำดับความเร็วสูงที่ระบุและตรวจสอบความแตกต่างของลำดับดีเอ็นเอที่แยกความแตกต่างระหว่างประชากรสองกลุ่มที่แตกต่างกันของ cfDNA มาจากแหล่งที่แตกต่างกัน (2) Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. คุณสมบัติสามประการของ cfDNA ทำให้เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพที่มีความสามารถในการตรวจจับการปฏิเสธหลังจากการปลูกถ่ายอวัยวะที่เป็นของแข็ง: สามารถหาได้จากการเจาะเลือดอย่างง่ายวัดความเข้มข้นที่แม่นยำและลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ระบุได้ง่าย Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. การใช้ cfDNA เป็นตัวบ่งชี้ทางชีวภาพสำหรับ ACR ก็มีประโยชน์เช่นกันเนื่องจากมันได้มาจากเซลล์ที่ได้รับบาดเจ็บของอวัยวะที่บริจาคดังนั้นจึงควรแสดงถึงการตายโดยตรงของเซลล์ที่เกิดขึ้นใน allograft Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). นอกจากนี้ cfDNA ยังคงรักษาลักษณะทางพันธุกรรมทั้งหมดของ DNA จีโนมดั้งเดิมทำให้วัสดุทางพันธุกรรมที่ปล่อยออกมาจากอวัยวะบริจาคจะแตกต่างจาก cfDNA ที่ได้มาจากเซลล์ของผู้รับที่ได้รับ apoptosis ธรรมชาติ (3)
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. การตรวจสอบสุขภาพ allograft บ่อยครั้งและแม่นยำเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการอยู่รอดของผู้รับการปลูกถ่ายระยะยาว For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). สำหรับการปลูกถ่ายหัวใจ (HT) endopsocardial biopsy (EMB) เป็นมาตรฐานทองคำในปัจจุบันสำหรับการตรวจหา ACR (4) However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). อย่างไรก็ตาม EMB มีค่าใช้จ่ายสูงและมีข้อ จำกัด ที่สำคัญซึ่งส่วนใหญ่เป็นเรื่องธรรมดาในการตรวจชิ้นเนื้ออวัยวะทั้งหมด (5-7) Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). ยิ่งไปกว่านั้นการรุกรานของ EMB ทำให้ผู้ป่วย HT เสี่ยงต่อภาวะแทรกซ้อน (6,8,9)
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). น่าเสียดายที่ปัจจุบันมีวิธีการที่ไม่อันตรายเช่น echocardiography หรือการถ่ายภาพด้วยคลื่นสนามแม่เหล็ก (MRI) ขาดความจำเพาะและความไวที่เพียงพอในการตรวจจับการปฏิเสธ (10-13) Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). biomarkers ในเลือดเช่น cfDNA เป็นทางเลือกที่มีแนวโน้มที่สามารถนำไปใช้ในการปฏิบัติทางคลินิกได้อย่างง่ายดาย (14-17)
จลนพลศาสตร์ของ CFDNA ที่อยู่ในช่วงของคุณภาพและการกลับคืน
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). เนื่องจาก cfDNA มาจากกระบวนการที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติของ apoptosis บุคคลทุกคนมีระดับ cfDNA ที่ตรวจพบได้ในเลือดของพวกเขา (18) For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. สำหรับบุคคลที่มีสุขภาพดีส่วนใหญ่ของ cfDNA หมุนเวียนมาจากเซลล์เม็ดเลือดที่มีการตายตามธรรมชาติที่เกี่ยวข้องกับการหมุนเวียนของเซลล์ Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). ระดับของ cfDNA ผันผวนได้จากหลายสาเหตุเช่นการติดเชื้อการผ่าตัดการบาดเจ็บหรือการออกกำลังกายที่ละเอียดถี่ถ้วน (2,19) Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. ดังนั้นการพัฒนาชุดทดสอบที่ใช้ cfDNA เพื่อตรวจจับการปฏิเสธจำเป็นต้องประเมินจลนศาสตร์ของการปล่อย dd-cfDNA ไปยังการหมุนเวียนหลังผู้รับการรักษา This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). การพิจารณานี้มีความสำคัญอย่างยิ่งเนื่องจากการเปิดตัว dd-cfDNA เมื่อเวลาผ่านไปการปลูกถ่ายอวัยวะนั้นมีความจำเพาะต่ออวัยวะ (20-22)
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). ตัวอย่างเช่น ณ วันที่ 1 post-HT ระดับเฉลี่ยของ dd-cfDNA คือ 3.8 ± 2.3% (20) However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). อย่างไรก็ตามภายใน 7 วันระดับของ dd-cfDNA ได้ลดลงอย่างรวดเร็วและยังคงอยู่ในระดับต่ำอย่างต่อเนื่อง (<1%) During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. ในช่วงที่มีการปฏิเสธอย่างเฉียบพลันในหัวใจพบว่าระดับของ dd-cfDNA นั้นเพิ่มขึ้นเป็น 4% –5% จากระดับพื้นฐานที่ประมาณ 0.06% ที่สังเกตได้ในระหว่างการนิ่งเฉย The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). จลนพลศาสตร์ของ dd-cfDNA ที่สังเกตได้ในการไหลเวียนของผู้รับ HT มีความคล้ายคลึงกับที่สังเกตหลังการปลูกถ่ายไต (22)
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. ในทางตรงกันข้ามผู้รับของการปลูกถ่ายปอดทวิภาคีพบว่ามีส่วน dd-cfDNA เฉลี่ย 26 ± 14% ในวันหลังผ่าตัด Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). นอกจากนี้การลดลงของ dd-cfDNA นั้นโดดเด่นด้วยระดับของ dd-cfDNA ที่ลดลงอย่างรวดเร็วภายในสัปดาห์แรก แต่จากนั้นชะลอตัวและโดยทั่วไปยังคงอยู่ที่ 1% –3% (21) However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. อย่างไรก็ตามเช่นเดียวกับการปลูกถ่ายหัวใจและไตในช่วงที่มีการปฏิเสธแบบเฉียบพลันระดับของ dd-cfDNA เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญปีนขึ้นไปสู่ระดับเฉลี่ย 14% –15%
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. ความแตกต่างของมวลเนื้อเยื่อและอัตราการหมุนเวียนของเซลลูลาร์สำหรับความแปรปรวนนี้ในระดับของ dd-cfDNA ที่ปล่อยออกมาหลังการปลูกถ่ายต้นและระหว่างการหยุด For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). ตัวอย่างเช่นความแตกต่างในการหมุนเวียนระดับ dd-cfDNA ในการปลูกถ่ายทวิภาคีแบบ quiescent และ single-lung สามารถอธิบายได้โดยความแตกต่างในการหมุนเวียนของเซลล์เท่ากับ 107 เทียบกับ 58 เซลล์ / วินาทีตามลำดับ (21) By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). ในทางตรงกันข้ามในหัวใจที่ได้รับการปลูกถ่ายอย่างสงบอัตราการหมุนเวียนของเซลล์เพียง 8 เซลล์ / วินาที (21-23) Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. ดังนั้นความเข้าใจในระดับที่คาดหวังของ dd-cfDNA ที่เกี่ยวข้องกับอวัยวะที่ได้รับนั้นเป็นสิ่งจำเป็นเพื่ออำนวยความสะดวกในการพัฒนาชุดตรวจเฉพาะอวัยวะที่ตรวจจับการปฏิเสธ Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. เมื่อจลนศาสตร์ของการปลดปล่อย cfDNA สำหรับอวัยวะใดอวัยวะหนึ่งเป็นที่เข้าใจกันแล้วมีวิธีการหลายวิธีในการหาปริมาณจำนวนที่สัมพันธ์กันของ dd-cfDNA
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. กลยุทธ์ในการแยกผู้รับ - VS DONOR-DERIVED CFDNA CFDNA ที่ผู้บริจาคได้รับ
ผู้บริจาค - ผู้รับเพศไม่ตรงกัน
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). สำหรับการปลูกถ่ายอวัยวะที่ผู้บริจาคเป็นเพศชายและผู้รับเป็นเพศหญิงห้องปฏิบัติการสามารถใช้ประโยชน์จากเพศที่ไม่ตรงกันในการคำนวณระดับ dd-cfDNA จากภายในสระว่ายน้ำ cfDNA ทั้งหมดของผู้รับ (17) Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). นักวิจัยแสดงให้เห็นถึงความเป็นไปได้ของวิธีการนี้ในตัวอย่างปัสสาวะที่ถ่ายจากผู้รับการปลูกถ่ายไตหญิงที่ได้รับไตจากผู้บริจาคชายและเมื่อพวกเขาได้รับการปฏิเสธพบว่าระดับ dd-cfDNA ในปัสสาวะของพวกเขาสูงขึ้น 17) Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. แม้ว่าวิธีการนี้จะช่วยให้การวินิจฉัยที่มั่นใจในการปฏิเสธใน allograft เพศไม่ตรงกันระหว่างผู้บริจาคและผู้รับมีไม่บ่อยนักและไม่สามารถใช้ได้ในระดับสากล
ความแตกต่างของลำดับดีเอ็นเอผู้บริจาค - ผู้รับ
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. การปลูกถ่ายอวัยวะยังสามารถถือได้ว่าเป็นการปลูกถ่ายจีโนมเนื่องจากเซลล์ภายในอวัยวะที่ปลูกถ่ายนั้นมีข้อมูลทางพันธุกรรมของผู้บริจาค As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). ดังนั้นแนวคิดของการปลูกถ่ายยีนจีโนม (GTD) จึงขึ้นอยู่กับความแตกต่างทางพันธุกรรมระหว่างผู้บริจาคและผู้รับที่สถานที่เฉพาะซึ่งจะสามารถยกระดับเพื่อระบุที่มาของ cfDNA หมุนเวียน (20-24) Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). ตามหลักการผู้รับจะเป็น homozygous สำหรับฐานเดียว (เช่น AA) และในพื้นที่เดียวกันผู้บริจาคจะเป็น homozygous สำหรับฐานอื่น (ตัวอย่างเช่น GG)
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). จากความแตกต่างทางพันธุกรรมระหว่างแต่ละบุคคลทำให้ตำแหน่งข้อมูลที่มีศักยภาพนับหมื่นในจีโนมสามารถสอบปากคำได้โดยใช้การจัดลำดับความเร็วสูงเพื่อจำแนก dd-cfDNA จากผู้รับ cfDNA (20,24) This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. แนวคิดนี้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกโดยใช้ตัวอย่างที่เก็บมาจากผู้บริจาคหัวใจเพื่อรับจีโนไทป์ผู้บริจาคก่อนสำหรับการจับคู่ผู้บริจาคและผู้รับแต่ละคน After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. หลังจากการแยกและจัดลำดับ cfDNA จากผู้รับแต่ละคนจะมีการกำหนดสัดส่วนของโมเลกุลเฉพาะผู้บริจาค In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). ในตัวอย่างที่ใช้ในระหว่างหรือก่อนเหตุการณ์ปฏิเสธการตรวจชิ้นเนื้อทันทีสัดส่วนของ polymorphisms เดี่ยวนิวคลีโอไทด์ (SNPs) ของผู้บริจาคพบว่าเพิ่มขึ้นจาก <1% เป็น> 3% –4% (24)
This early retrospective study has now been validated prospectively. การศึกษาย้อนหลังในช่วงต้นนี้ได้รับการตรวจสอบแบบทันที Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). ผู้รับการปลูกถ่ายหัวใจและปอดสำหรับผู้ใหญ่และเด็กได้รับคัดเลือกและจีโนไทป์สำหรับคู่ผู้บริจาคแต่ละคู่ได้รับผ่าน WGS โดยมีเครื่องหมายบ่งชี้ SNP ที่ให้ข้อมูล 53,423 ราย (20) Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). โดยรวมแล้วการตรวจหาการปฏิเสธแบบเฉียบพลันนั้นเหนือกว่าของ AlloMap ซึ่งเป็นวิธีการตรวจวินิจฉัยแบบไม่รุกล้ำที่ได้รับอนุมัติจากองค์การอาหารและยาแห่งแรกในการตรวจหา ACR หลังจาก HT ตามการวิเคราะห์ transcriptome (25)
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. การวิจัยยังแสดงให้เห็นว่า WGS ไม่เพียง แต่ให้ข้อมูลเกี่ยวกับการรับสินบน แต่ยังรวมถึงสถานะของภาวะภูมิคุ้มกันและภูมิคุ้มกันโดยรวมของผู้ป่วย This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). สิ่งนี้แสดงให้เห็นถึงข้อได้เปรียบที่ยิ่งใหญ่ที่ไม่สามารถหาได้โดยชุดทดสอบอื่น (26-28)
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. อย่างไรก็ตาม WGS เผชิญกับความท้าทายที่สามารถป้องกันไม่ให้ถูกนำไปใช้ในการปฏิบัติทางคลินิกเป็นประจำ For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. ตัวอย่างเช่นในขณะที่สามารถรับข้อมูลทางพันธุกรรมของผู้รับได้อย่างง่ายดาย แต่ก็ไม่เป็นความจริงเสมอไปสำหรับผู้บริจาค Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. ยิ่งไปกว่านั้น WGS มีค่าใช้จ่ายสูงใช้แรงงานมากและใช้เวลานาน
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). วิธีการทางเลือกใช้แผงของ SNPs polymorphic genotyped ที่ระบุไว้ในกลุ่มของ cfDNA ที่ถูกสกัดดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องมีความรู้เบื้องต้นเกี่ยวกับจีโนไทป์เฉพาะของผู้บริจาค (29) Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. ซึ่งแตกต่างจากการปลูกถ่ายไตและตับซึ่งมักเกิดขึ้นระหว่างบุคคลที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดคู่ผู้บริจาค - ผู้รับสำหรับการปลูกถ่ายหัวใจและปอดมักจะไม่เกี่ยวข้อง GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. GTD ต้องการจีโนไทป์ของผู้รับการปลูกถ่ายและผู้บริจาค However, in practice, donor genotype information is often unavailable. อย่างไรก็ตามในทางปฏิบัติแล้วข้อมูลจีโนไทป์ของผู้บริจาคมักไม่สามารถใช้ได้ Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. ที่นี่เราแก้ไขปัญหานี้โดยการพัฒนาอัลกอริทึมที่ประเมินระดับ dd-cfDNA ในกรณีที่ไม่มีจีโนไทป์ของผู้บริจาค Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. อัลกอริทึมของเราทำนายการปฏิเสธการออกแบบ allograft ของหัวใจและปอดด้วยความแม่นยำซึ่งคล้ายกับ GTD ทั่วไป We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. นอกจากนี้เราได้ปรับปรุงอัลกอริทึมเพื่อจัดการกับผู้รับและผู้บริจาคที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดซึ่งเป็นสถานการณ์ที่พบได้บ่อยในไขกระดูกและการปลูกถ่ายไต We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. เราแสดงให้เห็นว่าเป็นไปได้ที่จะประเมิน dd-cfDNA ในผู้ป่วยที่ได้รับการปลูกถ่ายไขกระดูกที่ไม่เกี่ยวข้องหรือเป็นพี่น้องของผู้บริจาคโดยใช้โมเดลมาร์คอฟที่ซ่อนอยู่ Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. ดังนั้นอัลกอริทึมจึงได้รับการพัฒนาสำหรับการปลูกถ่ายหัวใจและปอดซึ่งสันนิษฐานว่าจีโนไทป์ของผู้บริจาคเกิดขึ้นที่ความถี่เดียวกับประชากรทั่วไป Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. ขึ้นอยู่กับความถี่เหล่านี้และเปรียบเทียบกับจีโนไทป์ที่เป็นที่รู้จักของผู้รับส่วนของ dd-cfDNA สามารถประมาณได้อย่างน่าเชื่อถือจากกลุ่มทั้งหมดของ cfDNA ที่แยกได้จากตัวอย่างพลาสมาของผู้รับ
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. ในกรณีของการปลูกถ่ายปอดแบบจำลองจีโนมเดี่ยวนี้เมื่อเปรียบเทียบกับวิธีการที่ใช้ทั้งจีโนมของผู้บริจาคและผู้รับก็พบว่าให้เศษส่วนเทียบเคียงของ dd-cfDNA However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. อย่างไรก็ตามเมื่อนักวิจัยใช้อัลกอริทึมเดียวกันนี้กับ HT ระดับ dd-cfDNA โดยประมาณนั้นไม่มีความสัมพันธ์กันอย่างรุนแรงกับการปลูกถ่ายปอด This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. สิ่งนี้อาจเกี่ยวข้องกับ dd-cfDNA จำนวนสัมบูรณ์ที่ต่ำกว่าหลังจาก HT This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). นี่เป็นอีกตัวอย่างหนึ่งของจลนศาสตร์ของ cfDNA เฉพาะอวัยวะที่สามารถมีอิทธิพลต่อผลการทดสอบและต้องนำมาพิจารณา (30)
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. ในกรณีของการปลูกถ่ายไตการศึกษาในอนาคตได้ดำเนินการเพื่อยืนยันการใช้ประโยชน์ของระดับ dd-cfDNA ซึ่งระบุโดยใช้ SNP ที่ระบุโดยผู้บริจาคซึ่งเป็นเครื่องหมายที่ใช้งานได้สำหรับการปฏิเสธ In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). ในการศึกษาหนึ่งครั้งนั้นผู้รับการไต 384 คนได้รับการคัดเลือกจากคลินิก 14 แห่งเพื่อให้ตัวอย่างเลือดตามช่วงเวลาที่กำหนดและในเวลาที่มีการตรวจชิ้นเนื้อทางคลินิก (31) Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. โดยรวมแล้วการศึกษามุ่งเน้นไปที่ความสัมพันธ์ระหว่างเนื้อเยื่อวิทยาในตัวอย่างชิ้นเนื้อ 107 ชิ้นจากผู้ป่วย 102 รายและระดับของ dd-cfDNA ที่พบในตัวอย่างพลาสมาที่จับคู่ More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. โดยเฉพาะอย่างยิ่ง 27 ตัวอย่างการตรวจชิ้นเนื้อจาก 27 ผู้ป่วยที่มีการปฏิเสธการใช้งานที่ได้รับพร้อมกับ 80 ตัวอย่างการตรวจชิ้นเนื้อจาก 75 ผู้ป่วยโดยไม่ต้องปฏิเสธการใช้งาน
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. ในการศึกษาครั้งนี้การปฏิเสธแบบแอคทีฟนั้นรวมถึงการปฏิเสธแอนติบอดีที่มีฤทธิ์รุนแรง (AMR), AMR เรื้อรังและ ACR The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). การทดสอบที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ใช้การตัด 1% สำหรับส่วนของ dd-cfDNA เพื่อระบุว่ามีหรือไม่มีการปฏิเสธการใช้งานและพบว่ามีความจำเพาะ 85% (95% CI, 79% –91%) และความไว 59% (95% CI, 44% –74%) The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). ความไวของการทดสอบนี้ดีกว่าสำหรับการจำแนกระหว่าง AMR ที่ใช้งานและขาดเนื่องจากการใช้ cutoff 1% dd-cfDNA พบว่ามีความจำเพาะ 83% (95% CI, 78% –89%) และ 81% ความไว (95% CI, 67% –100%) Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. ในทั้งสองกรณีความไวลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อส่วนของ dd-cfDNA เกิน 3%
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). เพื่อปรับปรุงความจำเพาะและความไวของการทดสอบโดยใช้ cfDNA แบบ non-invasive เพื่อตรวจจับการปฏิเสธหลังจากการปลูกถ่ายไตผู้วิจัยยังได้ทำการสำรวจปริมาณที่แน่นอนของ dd-cfDNA (32-33) By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. ด้วยการซักถามปริมาณที่แน่นอนของ dd-cfDNA เราสามารถกำจัดการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นในส่วนของ dd-cfDNA เนื่องจากการเพิ่มขึ้นของระดับ cfDNA ทั้งหมดที่เกิดจากเหตุการณ์ที่ไม่ถูกปฏิเสธเช่นการติดเชื้อการบาดเจ็บหรือการออกกำลังกาย การทดสอบที่แม่นยำ
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). เพื่อศึกษาความเป็นไปได้นี้มีงานวิจัยหนึ่งงานใช้ชุดข้อมูลการคัดลอกข้อมูลจำนวน 32 ชุด (CNVs) ตามความถี่ของประชากรเมื่อเทียบกับสัดส่วนที่สัมพันธ์กันของผู้บริจาคและผู้รับ SNP ที่ตำแหน่ง (32) All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. CNV ทั้งหมดไม่ได้อยู่ในจีโนมของผู้รับ แต่มีอยู่ใน cfDNA ที่ถูกแยกดังนั้นจะถือว่าเป็นตัวแทนของ dd-cfDNA
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. ที่น่าสนใจในขณะที่ความจำเพาะและความไวเพิ่มขึ้นโดยรวมด้วยการใช้ระดับ dd-cfDNA แบบสัมบูรณ์ แต่การทดสอบนี้มีความสามารถมากขึ้นในการแยกแยะระหว่างการมีอยู่และไม่มี AMR ที่ใช้งานอยู่ซึ่งตรงข้ามกับกรณีของ ACR ที่ใช้งาน In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). นอกจากนี้ระดับ creatinine ในเลือดไม่เพียงพอในการแยกแยะระหว่างการปฏิเสธการใช้งานและความนิ่งซึ่งอาจเป็นเพราะมันบ่งบอกถึงการทำงานของไตมากขึ้นเมื่อเทียบกับความเสียหายของเนื้อเยื่อไต (31-33)
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). การศึกษาอื่นสำรวจระดับสัมบูรณ์ของ dd-cfDNA ในผู้รับการปลูกถ่ายไตที่เกี่ยวข้องกับระดับของ Tacrolimus ซึ่งเป็นภูมิคุ้มกัน Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. ที่นี่นักวิจัยพบว่าปริมาณที่แน่นอนของ dd-cfDNA นั้นสูงขึ้นอย่างมากในผู้ป่วยที่มีระดับ Tacrolimus ต่ำกว่า (<8 μg / L) เมื่อเทียบกับผู้ที่มีระดับยาสูงกว่า These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าระดับ dd-cfDNA นั้นยังมีศักยภาพในการตรวจหาการบาดเจ็บของ allograft ที่เกิดจากภูมิคุ้มกันไม่เพียงพอ
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. ห้องปฏิบัติการยังได้เสนอทางเลือกให้กับ WGS Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). กลุ่มของเราสำรวจการจัดลำดับเป้าหมายที่ 124 สูง polymorphic (ความถี่อัลลีลเล็กน้อย [MAF]> 0.4) SNPs โดยใช้พาเนลที่มีวางจำหน่ายในเชิงพาณิชย์การจัดลำดับยุคถัดไปและอัลกอริธึมใหม่ (34) This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. วิธีการนี้จะช่วยลดจำนวนการจัดลำดับที่ต้องการลดค่าใช้จ่ายและเวลาในการทดสอบลงอย่างมากและทำให้สามารถวิเคราะห์ได้อย่างรวดเร็ว However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. อย่างไรก็ตามเนื่องจากการทดสอบนี้อาศัยความแตกต่างใน MAF ระหว่างแต่ละบุคคลจึงไม่เหมาะสำหรับคู่บริจาคและผู้รับที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเช่นที่เห็นในการบริจาคไตที่เกี่ยวข้องกับชีวิต It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. มันจะต้องได้รับการตรวจสอบสำหรับการตรวจสอบเหตุการณ์การปฏิเสธปานกลางหรือมากกว่า
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). ห้องปฏิบัติการได้สำรวจโดยใช้ polymorphic SNPs เพื่อหาปริมาณ dd-cfDNA รวมกับเทคโนโลยีของ PCR แบบหยดดิจิตอล (30,35-37) Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). จากการใช้ 41 polymorphic SNPs ที่เสถียรไตและผู้รับ HT แสดงให้เห็นว่ามีสัดส่วน dd-cfDNA 2% –3% กับผู้รับการปลูกถ่ายตับที่มั่นคงซึ่งมีระดับ 7% (35)
สรุป
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. การใช้การตรวจชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อที่มีราคาแพงและมีการบุกรุกเพื่อตรวจจับการปฏิเสธ allograft มีข้อ จำกัด ที่สำคัญ As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. เช่นการทดสอบการบุกรุกน้อยที่สุดที่สามารถประเมินสุขภาพของอวัยวะที่ปลูกถ่ายทั้งหมดโดยตรงและแม่นยำหมายถึงจอกศักดิ์สิทธิ์ในการปลูกถ่ายอวัยวะที่เป็นของแข็ง
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. การใช้ cfDNA หลังจากการปลูกถ่ายได้แสดงให้เห็นถึงสัญญาเบื้องต้น แต่จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมและการตรวจสอบเพื่อปรับปรุงความเข้าใจของเราเกี่ยวกับชีววิทยาพื้นฐานของ cfDNA รวมถึงพฤติกรรมหลังการปลูกถ่าย At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. ในเวลานี้เป็นที่ชัดเจนว่าความแตกต่างเฉพาะอวัยวะสำคัญมีอยู่และรูปแบบของการปล่อย cfDNA อาจแตกต่างกันไปตามประเภทของเหตุการณ์การปฏิเสธ However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. อย่างไรก็ตาม cfDNA เป็นหนึ่งในเทคโนโลยีที่มีแนวโน้มมากที่สุดที่พัฒนาขึ้นเพื่อเติมเต็มหรือในที่สุดก็มาแทนที่การตรวจชิ้นเนื้อเนื้อเยื่อ